EB病毒gp85，N端片段的原核表达与初步鉴定

　　[摘要]：构建EB病毒基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达。分析非糖基化的EB病毒包膜糖蛋白gp85N端截短片段的抗原性。方法：采用基因工程技术，以B958细胞（美洲绒猴外周血B淋巴细胞经EBV转化后的细胞系）[1]培养上清为模板，用PCR扩增EB病毒的BXLF2基因N端片段。PCR产物经HindⅢ和XhoⅠ双酶切，插入原核表达载体pGEX5T中，构建pGEX5T85N重组表达质粒，并在大肠杆菌BL21中诱导表达gp85N蛋白。纯化表达的蛋白用Western blot鉴定，并免疫BALB/c小鼠。结果：序列分析表明，插入片段的序列与GenBank登录的参考序列完全一致。重组表达的蛋白的相对分子质量（Mr）约为45000，同预期的大小相符。以纯化的可溶性重组蛋白免疫BALB/c小鼠，经ELISA检测获得了高效价的抗血清，且抗gp85单克隆抗体（mAb）可识别所表达的gp85N抗原。Western blot显示，该抗原可与小鼠免疫血清起特异性反应。结论：表达并纯化的EB病毒截短的gp85N重组蛋白具有良好的抗原性，为下一步分析所产生抗体的生物学特性提供了条件。

　　[英文摘要]：To construct a prokaryotic recombinant vector of EpsteinBarr virus（EBV）membrane protein gp85，to express the protein in E。coli and characterize the antigenicity of this nonglycosylated protein。METHODS：The BXLF2gene coding5′terminal truncated of EBVgp85was amplified from the EBVstrain B958cell line with specific primers。After identification by the restriction digestion with Hind IIIand Xho I，the PCRproduct was inserted into the prokaryotic expression plasmid pGEX5Tand confirmed by sequencing。The constructed prokaryotic expression vector pGEX5T85Nwas transformed into the competent E。coli BL21。The expressed recombinant protein gp85Nwas purified by affinity chromatography，characterized by Western blot，and used immunize BALB/c mice。The titer of antisevum from the immunized mice was detected by ELISA。RESULTS：Sequencing analysis revealed that the obtained truncated BXLF2gene was identical to that published in GenBank and successfully cloned into pGEX5T。SDSPAGEshowed that the expressed recombinant protein was partially soluble with a relative molecular mass of45000。ELISAresults indicated that the expressed gp85Nwas recognized by that the antigp85mAb and contiserum with high titer was obtained from the immunized mice。CONCLUSION：The obtained recombinant gp85Nwith an excellent antigenicity should provide preliminary data for characterization of the antibody produced by the immunized mice。

　　[关键字]：EB病毒；，gp85，N端片段；，表达；，免疫原性

　　[论文正文]：EpsteinBarr病毒（EBV）属于疱疹病毒科γ疱疹病毒亚科成员，具有潜在的致癌性。该病毒在人类的感染率高达95%，主要感染B细胞和上皮细胞，是传染性单核细胞增多症、Burkitt淋巴瘤及鼻咽癌等多种肿瘤的重要致病因素。EBV对B细胞有高度的亲和力，其穿入B细胞时需要多种糖蛋白复合物的参与。其中糖蛋白gp85在病毒吸附和穿入靶细胞中起重要作用，是抗EBV感染的重要靶抗原之一[2-5]。EBV的gp85由BXLF2基因编码，其膜外区（N端）的抗原性较强，而且与EBV感染的关系密切。我们将BXLF2基因N端589bp的片断克隆至pGEX5T质粒中，构建了pGEX5T85N重组载体。将其转入宿主菌BL21中，在大肠杆菌内诱导表达了gp85N重组蛋白，采用谷胱甘肽琼脂糖珠对其进行纯化并对其免疫学特性进行了初步研究。

　　1材料和方法

　　1.1材料EB病毒B958细胞由第四军医大学免疫学教研室提供。原核表达载体pGEX5T及大肠杆菌BL21由本室保存。各种限制性内切酶、T4连接酶及蛋白marker均购自TaKaRa公司，引物由上海生物工程公司合成。质粒抽提、胶回收试剂盒购自上海华舜公司。二硫苏糖醇（DTT）及还原型谷胱甘肽，由厦门泰京生物工程公司提供。Bradford法测定蛋白试剂盒，购自上海申能博彩公司。福氏佐剂及谷胱甘肽琼脂糖珠，购自Sigma公司。BALB/c雌性小鼠购自上海中科院动物实验中心。HRP标记的羊抗鼠IgG购自ZYMED公司。抗gp85的单克隆抗体（mAb）由美国Florida大学HuttFletcher博士赠送。其他常规化学试剂均为分析纯。PE2400型DNA扩增仪ABI公司产品。Trans Blot SD半干电转印仪及FluorSTM Multilmager凝胶成像系统为BioRad公司产品。

　　1.2方法

　　1.2.1BXLF2基因N端片段的PCR扩增根据EB病毒的膜蛋白gp85BXLF2基因的序列，设计一对引物。P1:5′CG AAG CTT TGC AGT TGC TCT GTG TT3′含HindⅢ酶切位点，P2:5′CG CTC GAG ATG CAG TTG CTC TGT GTT3′含XhoⅠ酶切位点。以EB病毒B958细胞为模板，总PCR反应体积为50μL，包括引物P1、P2各30pmol，dNTP125μmol/L及Taq DNA聚合酶2U。PCR扩增条件：94℃预变性2min，94℃30s，50℃30s，72℃45s，共30个循环后，于72℃再延伸5min。PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

　　1.2.2重组质粒的构建和转化将上述PCR产物分别用HindⅢ和XhoⅠ双酶切，并与同样双酶切的GST融合表达载体pGEX5T进行连接，构建pGEX5T85N。以重组质粒转化感受态E。coli BL21细胞，阳性克隆进行双酶切鉴定，并将菌液送上海生物工程公司进行DNA序列测定。

　　1.2.3GSTgp85N融合蛋白的诱导表达挑取重组菌的单个菌落，接种于25mL LB（含氨苄青霉素）培养基中，于37℃摇床培养过夜。次日，按1∶30转种于500mL LB培养基中，于37℃振荡培养至A600=1.0左右，加IPTG（终浓度为0.4mmol/L）于18℃诱导表达20h；同时取1管未加IPTG作为阴性对照。菌液离心，收集菌体，重悬于8mL PBS（含10mL/L Triton X100及1g/L溶菌酶）中，于-70℃反复冻融以裂解菌体。以10000g离心收集上清和菌体沉渣，分别取少量进行100g/L SDSPAGE。

　　1.2.4重组蛋白的纯化取上述菌体的裂解上清，按说明书的方法，用谷胱甘肽亲和层析柱进行分离纯化，纯化产物的纯度经100g/L SDSPAGE进行分析。

　　1.2.5小鼠抗gp85N抗血清的制备以Bradford法测定蛋白浓度，按100μg纯化的gp85N抗原加入等体积的福氏完全佐剂，乳化后采用皮内、背部多点注射免疫5只6周龄的BALB/c雌性小鼠。初次免疫后，每隔3周用同样抗原加等体积福氏不完全佐剂加强免疫2次。

　　1.2.6抗血清效价的测定经优化条件，将纯化的gp85N抗原用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至10mg/L包被酶标微孔板，于4℃过夜。以PBS洗涤后，加含10g/L BSA的PBS封闭2h。充分洗涤后，分别加入不同稀释度和不同免疫周期的小鼠血清及抗gp85mAb，同时以PBS免疫小鼠的血清作为空白对照，以HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗，用底物TMB显色后，于波长450nm处测定抗血清的效价。

　　1.2.7目的蛋白表达的Western blot分析目的蛋白gp85N经SDSPAGE后，用Trans blot SD半干电转印仪转移至硝酸纤维素膜上，用含30g/L BSA的PBS4℃封闭过夜。洗涤后，依次滴加小鼠免疫血清（室温孵育1h，以PBST洗3次）及HRP标记的羊抗鼠IgG（同上孵育及洗涤），经30mL/L H2O2和3g/L4氯1萘酚显色后观察结果。

　　2结果

　　2.1BXLF2基因N端片段的扩增BXLF2基因N端片段的PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳显示，在Mr约为589bp处有一扩增条带，同预期的目的基因片段的大小相一致（图1）。

　　图1BXLF2基因N端片段PCR产物的琼脂糖分析（略）

　　Fig1Analysis of the PCRproduct of Nterminal fragment of BXLF2gene by agarose gel electrophoresis

　　1：Nterminal fragment of BXLF2gene；M：DNAmarker DL2000。

　　2.2pGEX5T85N重组质粒的酶切鉴定pGEX5T85N重组质粒经HindⅢ和XhoⅠ双酶切后，出现约5000bp的pGEX5T和约589bp的目的基因片段，与理论值相符（图2）。

　　图2pGEX5T85N重组质粒的酶切鉴定（略）

　　Fig2Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid pGEX5T85N

　　M：DNAmarker DL15000；1：pGEX5Tplasmid；2：Recombinant plasmid pGEX5T85N；3：pGEX5T85N/HindⅢ+XhoⅠ；4：Nterminal fragment of BXLF2gene。

　　2.3pGEX5T85N重组质粒DNA序列测定序列测定结果表明，重组质粒中所含的目的基因片断与BXLF2基因片段的阅读框序列（GenBank中的登录号为VO1555）完全一致，证明该重组质粒已插入了目的基因片断（图3）。

　　图3pGEX5T85N重组质粒的部分DNA序列（略）

　　Fig3The partial DNAsequence of pGEX5T85Ngene

　　2.4gp85N蛋白的诱导表达经IPTG诱导后，pGEX5T85N转化菌的菌体裂解物中，新出现1条Mr约为45000的蛋白带，同预期的融合蛋白GST85N的Mr相符；而未经诱导的菌体则无此条带出现（图4）。

　　图4表达的gp85N蛋白的SDSPAGE分析（略）

　　Fig4Analysis of expressed gp85Nrecombinant protein by SDSPAGE

　　1：Lysate of bacteria transformed with pGEX5Twithout induction；2：Lysate of bacteria transformed with pGEX5Twith IPTGinduction；3：Lysate of bacteria transformed with pGEX5T85Nwithout induction；4，5：Lysate of bacteria transformed with pGEX5T85Nwith IPTGinduction；M：Protein marker。

　　2.5重组gp85N蛋白的纯化将pGEX5T85N转化的表达菌经-70℃反复冻融后，上清液中有部分可溶性的目的蛋白。将其用谷胱苷肽琼脂糖珠纯化后，在Mr为45000处有1条较纯的蛋白表达条带，同预期蛋白的大小一致（图5）。

　　图5纯化前后表达的重组gp85N蛋白的SDSPAGE分析（略）

　　Fig5SDSPAGEanalysis of expressed the recombinant gp85Nprotein

　　1：Supernatant of expressed bacteria after disintegration；2：Precipitation of expressed bacteria after disintegration；3：Purified GSTgp85Nfusion protein；M：Protein marker。

　　2.6抗血清效价的ELISA检测以免疫前的小鼠血清及用PBS免疫的小鼠血清作为阴性对照，将收集的不同免疫时间段的小鼠抗血清和抗gp85mAb作倍比稀释后，用间接ELISA法测定免疫小鼠血清和与mAb的免疫活性，以P/N≥2.1的血清最高稀释度为抗体效价。结果表明，免疫8周的小鼠抗血清的效价达1∶24000，mAb的效价为1∶200。