抗人可溶性间皮素相关蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定

　　[摘要]：制备鼠抗人可溶性间皮素相关蛋白（SMR）的单克隆抗体（mAb），鉴定其生物学特性。方法：应用计算机通过综合预测对间皮素（MSLN）进行B细胞表位预测。合成相应肽段并免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术制备mAb，利用免疫细胞化学和Western blot分析对所制备的mAb进行鉴定。结果：综合预测方法分析间皮素的抗原表位可能于153-162、282-292及471-481氨基酸残基或其附近，选择性合成了可能性最高的位于471-481氨基酸残基的可溶性间皮素相关蛋白表位，制备了mAb（2H10），经免疫细胞化学和Western blot分析该抗体具有较高的特异性。结论：成功地制备了鼠抗人可溶性间皮素相关蛋白的mAb（2H10），该抗体具有较高的特异性，为进一步利用ELISA对可溶性间皮素相关蛋白进行检测奠定了基础。

　　[英文摘要]：To prepare the monoclonal antibody（mAb）against human soluble mesothelinrelated proteins（SMR）and identify its properties。METHODS：The Bcell epitopes of mesothelin（MSLN）were predicted by multiparameter prediction method。Then BALB/c mice were immunized with compound MSLNpolypeptide prepare the mAb by hybridoma technique。The specificity of antibody was evaluated by immuocytochemistry and Western blot respectively。RESULTS：Using the multiparameter prediction of Bcell epitopes，the471-481epitope domain was selected and synthesized。Then the mice were immunized and mAb against human SMRwas prepared and designated2H10。The specificity of mAb2H10was evaluated to be high by using immuocytochemistry and Western blot。CONCLUSION：The successful preparation of the mAb against SMRwill provide efficient reagent for further detection of SMRby ELISA。

　　[关键字]：间皮素；可溶性间皮素相关蛋白；B细胞表位；单克隆抗体

　　[论文正文]：

　　间皮素（mesothelin，MSLN）是一种相对分子质量（Mr）约为40000的细胞表面糖蛋白，在间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌等恶性肿瘤中高表达[1，2]。间皮素cDNA编码Mr为69000的前体蛋白，糖基化后被蛋白酶水解为40000和31000的片段，其中40000的片段通过糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol）与胞膜相连，称为间皮素；Mr31000的片段脱落后称为巨核细胞集落刺激因子（megakaryocytepotentiating factor）[2]。间皮素包括两个异构体，其中异构体2由于保留了第16和17外显子间的内含子，使其蛋白翻译提前终止，从细胞表面脱落形成可溶性间皮素（solublemesothelinrelatedproteins，SMR），Mr为42000～45000[3]。癌组织中间皮素阳性表达的恶性肿瘤患者，其血清和腹水中可以检测到SMR的存在，从而使之有可能成为新的恶性肿瘤监测指标[4]。但到目前为止，国内仍无可以检测SMR的ELISA试剂盒。基于这一目的，本研究中选择性地合成了鼠抗人SMR的多肽制备其单克隆抗体（mAb），并对其生物学特异性进行了鉴定。

　　1材料和方法

　　1.1材料GOLDKEY核酸和蛋白质分析软件及核酸和蛋白质数据库光盘，由中国军事医学科学院基础研究所提供。卵巢浆液性囊腺癌细胞系OVCAR3、浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3及卵巢上皮性癌细胞系3AO均为本院科研中心冻存。Sp2/0骨髓瘤细胞株为解放军国际和平医院试验中心冻存。BALB/c小鼠（鼠龄6～8周，质量18～25g）购自河北医科院实验动物中心。DMEM培养基、RPMI1640培养基为美国GIBCO公司产品。胎牛血清为杭州四季青公司产品。小鼠SP检测和DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥公司。蛋白提取试剂盒和protein marker为赛百盛公司产品。考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，mAb分型试剂盒购于美国Boehriger公司。

　　1.2方法

　　1.2.1单参数预测、综合预测及抗原肽合成应用GOLDKEY软件分析间皮素氨基酸序列全长，应用4个主要参数：Hopp&Woods亲水性参数（Hydrophilicity），Welling抗原性参数（Antigenicity），可及性参数（Accessibility）和二级结构（The secondary structures）对抗原表位分别进行单参数预测，均高于域值的峰为预测出的位点。其中间皮素氨基酸序列全长如下：

　　1malptarpll gscgtpalgs llfllfslgw vqpsrtlage tgqeaapldg vlanppniss

　　61lsprqllgfp caevsglste rvrelavala qknvklsteq lrclahrlse ppedldalpl

　　121dlllflnpda fsgpqactrf fsritkanvd llprgaperq rllpaalacw gvrgsllsea

　　181dvralgglac dlpgrfvaes aevllprlvs cpgpldqdqq eaaraalqgg gppygppstw

　　241svstmdalrg llpvlgqpii rsipqgivaa wrqrssrdps wrqpertilr prfrrevekt

　　301acpsgkkare ideslifykk weleacvdaa llatqmdrvn aipftyeqld vlkhkldely

　　361pqgypesviq hlgylflkms pedirkwnvt sletlkalle vnkghemspq aprrplpqva

　　421tlidrfvkgr gqldkdtldt ltafypgylc slspeelssv ppssiwavrp qdldtcdprq

　　481ldvlypkarl afqnmngsey fvkiqsflgg aptedlkals qqnvsmdlat fmklrtdavl

　　541pltvaevqkl lgphveglka eerhrpvrdw ilrqrqddld tlglglqggi pngylvldls

　　601mqealsgtpc llgpgpvltv lalllas

　　综合预测采用抗原性指数分析曲线[5]与上述单参数方法对照，以避免一种预测方法所造成的误差。抗原肽的合成：利用酪氨酸具有两个氨基的特殊结构，先合成具有4个氨基末端的酪氨酸核心，肽链从C端向N端延伸，以每个氨基为起点按预先选定的氨基酸序列合成（由北京宣武医院多肽实验室ABI433A型多肽自动合成仪合成）。

　　1.2.2鼠抗人SMRmAb的制备应用硝酸纤维素膜剪成02×05cm，在含SMR复合肽抗原的溶液中浸泡过夜，应用包埋法背部皮下免疫BALB/c小鼠。分别于初次免疫后14d、28d后进行两次加强免疫，方法同第1次，末次免疫后3d，在无菌条件下取出脾脏，研磨使脾细胞游离，GKN缓冲液洗涤，1000r/min离心5min，弃上清，重复离心1次，沉淀的细胞用10mL无血清DMEM培养液重悬。将骨髓瘤细胞Sp2/0在1g/L与脾细胞按1∶7的比例PEG作用下按常规方法融合。用间接ELISA法检测各孔产生抗SMR抗体的阳性克隆。对阳性克隆细胞采用限界稀释法进行单克隆培养。抗体的大量制备采用小鼠腹腔注射法。先于BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞10d后收集腹水，离心取上清液，冻存于冰箱。

　　1.2.3mAb的效价及亚类鉴定（1）效价测定：利用SMR复合肽抗原（1μg/L）1∶1000稀释包被微孔板，利用ELISA法检测抗体效价。（2）抗体亚类测定：用mAb亚类分型试剂盒，按试剂盒说明书操作。

　　1.2.4特异性鉴定（1）SP免疫细胞化学法：盖玻片放置于无菌6孔培养板中，加入对数生长期的人卵巢癌细胞系OVCAR3、SKOV3、3AO，制成细胞爬片。采用链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶（SP）连接法，检测制备的mAb与天然蛋白反应的特异性。以胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。以上实验重复3次。（2）Western blot检测mAb的特异性：分别收取OVCAR3、3AO、SKOV3等3组细胞，用蛋白提取试剂盒收取细胞蛋白，考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒对收取的各组蛋白进行定量，取等量蛋白（50μg）行SDSPAGE电泳，将蛋白转移至PVDF膜上，加入一抗[分别为鼠抗人间皮素mAb（克隆号K1，美国ZYMED公司产品，稀释度为1∶150）和制备的mAb2H10（稀释度为1∶200）]。空白对照以PBS代替一抗。以上实验重复3次。

　　2结果

　　2.1人间皮素B细胞抗原表位的多参数预测和抗原肽合成高于预测域值的氨基酸残基所对应的肽段即为预测的抗原表位。应用不同预测方法所预测的多个抗原表位个数和抗原表位可能出现的肽段的位置有所不同，但在氨基酸序列153-162、282-292及471-481等3个肽段，多种预测方法所预测的结果一致，有较好的亲水性和可及性，在二级结构上含有易形成抗原表位的不规则卷曲和β转角结构。因此，间皮素的B细胞抗原表位可能位于此区域或它们附近。其中297-600氨基酸序列为SMR，我们选择合成了间皮素分子N末端氨基酸残基471-481片段，含有11个氨基酸残基，顺序为QDLDTCDPRQL。对人间皮素序列中N末端471-481的11个氨基酸残基进行了短肽合成，将抗原肽与KLH结合形成复合肽抗原，为淡黄色固体，用1mg免疫小鼠。

　　2.2鼠抗人SMRmAb的制备应用SMRKLH作为免疫原，采用皮下包埋法多次免疫小鼠，获得了分泌抗SMR抗体的小鼠脾细胞，在PEG的诱导下小鼠脾细胞能较好的与Sp2/0骨髓瘤细胞在体外进行融合，形成杂交瘤细胞株，经间接ELISA法，筛选出抗SMR多肽抗体的杂交瘤细胞2株，分别为2H10、6D9，经反复传代和冻融，能稳定分泌抗体的2H10株，扩大培养，制备小鼠腹水，产生抗SMRmAb，抗体效价为1∶102400。mAb（2H10）的IgG亚类为IgG1（重链），轻链为κ链。

　　2.3mAb的特异性鉴定（1）免疫细胞化学SP法检测结果：经市售抗间皮素抗体（5B2）证实，卵巢癌细胞系OVCAR3、SKOV3、3AO均为间皮素阳性。本试验制备的抗SMR抗体2H10可以与上述3种细胞反应，均在细胞膜上可见明显的棕黄色颗粒沉着（图1）。（2）Western blot检测结果：对多肽经SDSPAGE分析用商售抗间皮素抗体K1和分别染色均在抗体2H10Mr在40000左右得到单一条带（图2）。

　　图1鼠抗人间皮素mAb特异性分析的免疫细胞化学检测（略）

　　Fig1Analysis of specificity of mice mAb against MSLNby immunocytochemistry（×400）

　　A：5B2+OUCAR3；B：5B2+SKOV3；C：5B2+3AO；D：2H10+OUCAR3；E：2H10+SKOV3；F：2H10+3AO。

　　图2鼠抗人间皮素抗体2H10特异性的Western blot检测（略）

　　Fig2Western blot analysis of specificity of mice mAb2H10against SMR