抗温和气单胞菌单克隆抗体的制备及初步鉴定

　　[摘要]：制备抗温和气单胞菌（Aeromonas sobria，As）单克隆抗体（mAb）并进行鉴定。方法：以灭活的温和气单胞菌免疫BALB/c小鼠，采用常规杂交瘤技术制备抗温和气单胞菌mAb。用间接ELISA法对mAb的特性进行初步鉴定。结果：获得6株能稳定分泌抗温和气单胞菌mAb的杂交瘤细胞株，分别命名为1A8、2A8、2F11、3C6、3D11、4G2。经测定杂交瘤细胞培养上清及其诱生的腹水mAb效价分别为1×10-2～1×10-3、1×10-5～1×10-6。6株杂交瘤细胞系所分泌的mAb亚类是：2A8、2F11为IgG1，1A8、3D11为IgG2a，3C6为IgG2b，4G2为IgG3。其中mAb3C6经交叉反应试验证明，与弧菌属其他几种细菌均不起反应，特异性强。结论：成功地制备了抗温和气单胞菌mAb的杂交瘤细胞株，为该病的免疫学诊断及防治提供了基础。

　　[英文摘要]：

　　[关键字]：温和气单胞菌；，单克隆抗体；，杂交瘤

　　[论文正文]：

　　温和气单胞菌是我国养殖淡水鱼类及海产品中最常见的致病性弧菌之一[1]，也是我国沿海地区人群中最常见的致病性弧菌之一[2]。此菌可以通过受感染的鱼类经消化道感染人，造成腹泻、败血症等疾病而严重威胁人类健康。目前，对温和气单胞菌病的临床诊断还是依赖临床观察、解剖及一般细菌学检查方法，其检测速度和准确性均受到一定的限制。对该菌病的防治主要是使用抗生素及其他化学药物等传统方法，对鱼类食物的营养品质和环境卫生都存在极大的损害。而单克隆抗体（mAb）应用在致病性细菌的诊断及防治等方面有其他方法所无法比拟的优越性。鉴于国内外尚未见抗该菌mAb的报道，我们制备了抗该菌的mAb，以为该病的免疫学诊断及防治提供基础。

　　1材料和方法

　　1.1材料温和气单胞菌由福建省淡水水产研究所提供，经第四军医大学附属西京医院检验科全自动细菌生化鉴定仪鉴定证实。骨髓瘤细胞Sp2/0细胞，系第四军医大学国家“863”课题组惠赠，融合前使细胞处于对数生长期。BALB/c小鼠8周龄、雌性，由本校实验动物中心提供。HRP标记的羊抗鼠IgG抗体购自华美生物工程公司。Ig亚类鉴定试剂盒系本校免疫学教研室惠赠。

　　1.2方法

　　1.2.1mAb的制备以40g/L甲醛溶液灭活的温和气单胞菌为免疫原，经腹腔免疫BALB/c小鼠（1×108菌体/只）。于1、7、14、21d各免疫1次，最后1次免疫3d后按常规方法进行融合、筛选、克隆化及制备腹水[3]。mAb的效价测定和Ig亚类鉴定，参照文献[3]的方法。mAb与其他相关菌的交叉反应性采用间接ELISA法。

　　1.2.2mAb特性的初步鉴定mAb与其他相关细菌的反应测定：豚鼠气单胞菌和嗜水气单胞菌由福建省淡水水产研究所提供，其他所用标准菌株均购自北京生物制品研究所，以间接ELISA法检测。

　　2结果

　　2.1杂交瘤细胞系的建立共进行2次细胞融合，融合率分别为635%、561%。抗体阳性率分别为283%、306%。克隆化后，共获得6株能稳定分泌mAb的阳性细胞株，分别命名为：1A8、2A8、2F11、3C6、3D11和4G2。

　　2.2mAb的特性鉴定（1）效价测定：杂交瘤细胞培养上清及BALB/c小鼠腹水mAb的效价分别为1×10-2～1×10-3和1×10-5～1×10-6。（2）mAb的Ig亚类鉴定：经鉴定2A8、2F11为IgG1，1A8、3D11为IgG2a，3C6为IgG2b，4G2为IgG3。（3）mAb与其他相关细菌的交叉反应试验[4，5]见表1。

　　表1抗温和气单胞菌mAb与相关菌的反应性（略）

　　3讨论

　　气单胞菌的组成以嗜水气单胞菌和温和气单胞菌占绝对优势[6，7]。温和气单胞菌是一类主要分布于淡水水体的细菌，可见于河流、湖泊、池塘等多种水域，鱼类温和气单胞菌感染最严重的是可以引起出血性败血症，此病常暴发流行，死亡率极高，严重危害渔业、水产业的发展。此菌可通过受感染的鱼类或被污染的水源经消化道感染人而造成腹泻，其引起肝胆疾病及恶性肿瘤等免疫功能低下者的感染病例不断增加，病死率较高[8]，目前认为其产生的肠毒素和细胞毒素是主要的致病因素[9]。以往对该菌的分离鉴定多采用常规方法，操作技术较繁琐，实验项目多达几十种，鉴定成本高昂，且需观察4～7d才能作出报告，常给实验诊断带来困难。而mAb应用可以克服该菌传统诊断及防治等方面的显著缺点。我们用甲醛灭活的温和气单胞菌菌体免疫BALB/c小鼠，经筛选、克隆化得到6株能稳定分泌mAb的杂交瘤细胞系，其中1株经交叉反应试验证明，与弧菌属其他几种细菌均不起反应，特异性强。其他几株mAb则与弧菌属其他几种常见细菌存在不同程度的交叉反应。根据以上结果，mAb3C6可用于特异性地检测温和气单胞菌、建立检测该菌的免疫学方法和以免疫组织化学方法检测出该菌感染的病理标本。抗温和气单胞菌mAb的成功制备为该菌的免疫学检测及防治提供了有用试剂。

　　参考文献：

　　[1]赵俊华，杨泽，曾卫东，等。出口水产养殖场鲜活淡水鱼和塘水中致病性弧菌的调查研究[J]。旅行医学科学，2004，10（2）：1-15。

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　　[3]徐志凯。实用单克隆抗体技术[M]。西安：陕西科学技术出版社，1992:27-102。

　　[4]李别虎，李元，白光春，等。抗创伤弧菌单克隆抗体细胞系的建立及其特性鉴定[J]。细胞与分子免疫学杂志，2001，17（1）：78。

　　[5]夏永娟，黄威权，李元，等。抗鳗弧菌单克隆抗体细胞系的建立及其特性鉴定[J]。细胞与分子免疫学杂志，2000，16（1）：81。

　　[6]Ghenghesh KS，ElGhodban A，Dkakni R，et al。Prevalence，species differentiation，haemolytic activity，and antibiotic susceptibility of aeromonads in untreated well water[J]。Mem Inst Oswaldo Cruz，2001，96（2）：169-173。

　　[7]Park YH，Lee HC，Song HG，et al。Recent increase in antibiotic-resistant microorganisms in patients with spontaneous bacterial peritonitis adversely affects the clinical outcome in korea[J]。J Gastroenterol Hepatol，2003，18（8）：927-933。

　　[8]曲芬，崔恩博，夏光明，等。肝硬化气单胞菌败血症50例临床特征及转归[J]。中华内科杂志，2003，42（12）：840-842。

　　[9]Martins LM，Marquez RF，Yano T。Incidence of toxic Aeromonas isolated from food and human infection[J]。FEMS Immunol Med Microbiol，2002，32（3）：237-242。