细胞色素P450，3A4抗原表位的分析及其抗体的制备与鉴定

　　[摘要]：制备兔抗人细胞色素P4503A4（CYP3A4）抗体及其特性鉴定。方法：利用生物信息学方法分析CYP3A4蛋白的序列，根据亲水性、抗原性、柔韧性及表面性等指标选择多肽序列，合成CYP3A4多肽，与载体蛋白钥孔戚血蓝素（KLH）偶联，免疫日本大耳白兔制备抗CYP3A4抗体。辛酸硫酸铵法纯化抗体，间接ELISA测定抗体的效价及相对亲和力常数，Western blot鉴定其特异性，免疫组化进行定位。结果：获得针对小分子CYP3A4的抗体。该抗体效价为1∶16000；相对亲和力常数在105～106M-1，具有实用价值；可与CYP3A4合成肽及天然CYP3A4出现特异性反应；可识别正常人肝脏组织CYP3A4；Western blot的结果显示，该抗体识别的相应抗原的相对分子质量（Mr）为46000。结论：合成的多肽KLH复合物具有免疫原性，可用于制备相应的抗体。制备的兔抗CYP3A4合成肽抗体可应用于ELISA、Western blot和免疫组化实验。

　　[英文摘要]：

　　[关键字]：CYP3A4；，合成肽；，多克隆抗体，

　　[论文正文]：细胞色素3A4（CYP3A4）是细胞色素P450超家族成员之一，主要存在于肝脏中、小肠中。它是人类药物代谢酶中的最重要的酶，在临床上超过半数的药物完全或部分地被该酶代谢[1]。CYP3A4与外源性致癌物、抗癌药物和内源性类固醇激素、维生素、脂肪酸的代谢转化密切相关[2，3]。目前，国外已研制出抗CYP3A4的抗体并且应用试验中；而国内在研制CYP450抗体领域属于空白阶段，我们研制出针对278-292位的抗人CYP3A4抗体，并将对CYP3A4功能的研究、体外药物代谢及对其基因表达调控的肿瘤防治提供新的思路。

　　1材料和方法

　　1.1材料日本大耳白兔，雄性，6周龄，由哈尔滨医科大学动物实验中心提供。福氏佐剂及3，3，5，5四甲基联苯胺（TMB）均购自Sigma公司。HRP山羊抗兔IgG购自Jackson ImmunoResearch公司。牛血清白蛋白（BSA）购自Solarbio公司。硝酸纤维素膜（NC）购自BIORAD公司。ECL Plus购自Amersham Biosciences公司。即用型SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯。多肽合成及其与KLH、BSA的联接由北京中科亚光生物有限公司完成。正常人肝脏组织，由“人类肝脏蛋白质组计划”项目提供。

　　1.2方法

　　1.2.1CYP3A4抗原表位的分析由SWISS PROT网站获知CYP3A4蛋白的序列，然后利用DNAStar软件分析其序列的特点，确定278-292位15个氨基酸作为欲合成的多肽序列：SQNSKETESHKALSD。

　　1.2.2CYP3A4多肽的合成及其与KLH和BSA的交联CYP3A4多肽由北京中科亚光生物有限公司合成；获得的多肽经常规C18的RP2HPLC柱进行纯化，纯度达95%。CYP3A4与KLH和BSA的交联采用戊二醛连接法，将5mg合成多肽分别加入7mg KLH和BSA中，边振荡边缓慢加入新鲜配制的3g/L的戊二醛溶液（1mL），室温作用2h。以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜，交联成CYP3A4KLH、CYP3A4BSA偶联物。

　　1.2.3兔抗CYP3A4多肽抗体的制备每只取200μg多肽KLH偶联物与等量的完全福氏佐剂充分乳化后，于兔背部皮下多点注射，每点约100μg。2周后加强免疫，剂量同前，用不完全福氏佐剂充分乳化后，于兔背部皮下多点注射；以后隔2周加强1次；从第3次加强免疫开始，每次免疫后7d，经耳缘静脉采血测定抗体的效价[4，5]。经4次加强免疫后，符合要求，立即颈动脉取血。分离血清后，无菌分装保存于-80℃备用。

　　1.2.4人肝脏微粒体蛋白制备取10g正常人的肝脏、剪碎，用磷酸钾盐缓冲液反复冲洗除去血红蛋白后，加入上述磷酸钾盐缓冲液制成肝匀浆。然后将肝匀浆依次于4℃以10000g离心30min，取上清液，以30000g离心60min，取上清液及100000g离心60min，取沉淀后，悬浮于磷酸钾盐缓冲液（含有200mL/L甘油，5g/L胆酸钠，2mg/L抑肽酶，2mg/L亮肽素，1mg/L胃酶抑素及1mmol/L苯甲基磺酰氟）中，用Bradford法进行蛋白定量。分装后，置于-80℃冰箱内贮存备用。

　　1.2.5抗血清的纯化用醋酸钠缓冲液（60mmol/L，pH=4.0）将抗血清稀释3～4倍，0.1mol/L NaOH调节pH至4.5，缓慢滴加辛酸至浓度为25mL/L，室温搅拌30min。4℃10000g离心30min，弃沉淀后滤膜（0.22μm）过滤，加入1/10体积的10×PBS，用0.1mol/L NaOH调节pH至7.4，缓慢加入预冷的饱和硫酸铵至45%饱和度，混合后4℃过夜。4℃3000g离心30min，弃上清后，用0.01mol/L PBS（pH=7.4）重悬，透析过夜。用Branford法进行蛋白定量。经SDSPAGE分离后，用BIORADquantity one软件分析其纯度。

　　1.2.6ELISA检测抗血清效价ELISA检测板用以多肽BSA偶联物以1mg/L的浓度包被，每孔100μL，4℃孵育过夜后，用10mL/L的牛血清封闭，每孔200μL，37℃2h后，洗涤备用。取出包被好的检测板，每孔加入按1∶2梯度稀释的抗血清100μL（对照为正常兔血清），37℃孵育30min，洗涤3次后每孔加入1∶5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG100μL，37℃孵育15min，洗涤3次后进行TMB显色，37℃孵育15min，终止反应后，用酶标仪式测定样品A450值。

　　1.2.7间接ELISA检测抗血清亲和常数ELISA检测板分别用多肽交联BSA包被成5mg/L和10mg/L，封闭后加入倍比稀释的已知蛋白浓度的纯化后的多抗，再加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗，TMB显色测定A450。以抗体浓度的对数为横坐标，A值为纵坐标作图。以曲线达到水平的A值为100%，求出A50即50%A值时对应的抗体浓度。按照Kaf f=（n－1）/2（n[Ab’]t－2[Ab]t）算出抗体亲和常数，其中[Ab’]t、[Ab]t指的是A50时即包被分别5mg/L和10mg/L时抗体半饱和时抗体的摩尔浓度，[Ag]t，[Ag’]t指的是包被的抗原浓度本实验中即指10μg和5μg，n=[Ag]t/Ag’]t，本实验中n=2[6]。

　　1.2.8多克隆抗体的Western blot分析用2×SDS上样缓冲液悬浮制备的人肝脏微粒体蛋白、多肽BSA及BSA，于95℃加热5min，置于冰上冷却10min。上样量分别为70、15和15μg，经SDSPAGE分离后，以湿转法电转至硝酸纤维素膜上。经脱脂奶粉封闭（室温1h）后，依次滴加1∶1000稀释抗血清（4℃过夜，以1mL/L Tween20TBS洗膜3次）及1∶10000HRP山羊抗兔IgG（室温孵育1h，以1mL/L Tween20TBS洗膜3次）。用化学发光剂试剂盒（ECL Plus）处理5min后，于暗室曝光到X胶片上显影、定影。

　　1.2.9多克隆抗体的免疫组化染色取出用丙酮固定的冰冻人正常肝脏组织切片，滴加50g/L BSA，室温下封闭20min，加入1∶1000稀释兔抗人CYP3A4多肽抗体，4℃孵育过夜。PBS洗片后加入羊抗兔IgGHRP，37℃孵育20min，PBS洗片后进行DAB显色，苏木素复染，返蓝后，脱水、透明、封片，镜检，放大400倍拍照记录结果[7]。

　　2结果

　　2.1CYP3A4的氨基酸序列分析用DNAStar软件对蛋白序列进行分析（图1），根据亲水性、抗原性、表面性及柔韧性4个参数预测的结果进行综合考虑，选取欲合成的多肽序列为278-292位氨基酸（图中阴影区）：SQNSKETESHKALSD。

　　图1DNAstar软件对人CYP3A4蛋白序列参数的预测略

　　2.2CYP3A4合成肽抗原的合成与纯化化学合成的多肽经HPLC纯化后，纯度可达95%，交联KLH后可作为抗原免疫动物。

　　2.3抗血清的特性鉴定①效价测定：间接ELISA法检测表明，抗血清的效价为1∶16000。②相对亲和力常数测定：纯化抗血清按1∶2的蛋白浓度倍比稀释，绘制标准曲线如图2所示，结果表明相对亲和力常数在105～106M-1。③抗体特异性鉴定：以制备的人肝脏微粒体蛋白、多肽BSA、BSA作为抗原，以兔抗血清作为一抗进行Western blot分析显示，抗血清与人肝脏微粒体蛋白在Mr约为46000处出现1条清晰带，与CYP3A4Mr相符；与多肽BSA在Mr约为69000处出现1条清晰带，与BSA Mr相符；而与BSA则无条带出现（图3）。说明所制备的抗体可识别含有半抗原的抗原表位的蛋白并能与天然CYP3A4蛋白结合。

　　图2－图3略

　　2.4兔抗人CYP3A4多克隆抗体的免疫组化定位CYP3A4主要分布在内质网和线粒体内膜，而二者位于胞质中。经免疫组化实验证明，CYP3A4多肽多克隆抗体可与正常人肝细胞胞质中的CYP3A4蛋白结合（图4）。

　　图4兔抗人CYP3A4多克隆抗体的免疫组化定位分析略

　　3讨论

　　国外Abcam、Researchd、Cypex公司已研制出用于ELISA、Western blot和免疫组化的抗CYP3A4抗体，但上述公司抗体仅能应用部分试验。而本实验室的抗CYP3A4抗体可完全用于以上试验。表位是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，找到一个抗原的表位，就可能研制出针对该抗原的抗体或疫苗。结合现代生物信息学，用多参数的综合预测抗原表位可以提高预测的准确性[8]。本实验中进行蛋白质序列表位分析时，着重考虑了以下几个方面[9]：①亲水性高。疏水性片段往往为跨膜成分或嵌入膜成分；而亲水性片段多暴露在脂质双分子膜外，容易形成抗原识别位点。②表面可及性强。③柔韧性好，更易形成三维结构，暴露抗原表位。④连续性表位的氨基酸残基数在10～20之间为宜，过短时不易形成明显的表位，过长则合成时发生错误的机会增加。根据以上原因最终确定以亲水性强、抗原指数高、表面性及柔韧性好的区域（即278-292位14个氨基酸）作为CYP3A4的抗原决定簇。虽然合成肽与载体蛋白（KLH）偶联可增加免疫原性，但也会产生一定的抗KLH的抗体[10]。所以，在间接ELISA法中包被抗原用多肽BSA而不是多肽KLH，以避免KLH的干扰。同样原因，在Western blot实验中，用多肽BSA和BSA各作抗